2013医学检验辅导：HLA细胞法分型试验

　　HLA-D和DP位点的抗原须用细胞法分型进行鉴定，所以又称LD抗原(lymphocytedefinedantigen)，其鉴定方法普遍采用混合淋巴细胞培养(mixedlymphocyteculture，MLC)，也称混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction，MLR)。

　　1.试验方法将分离的反应细胞(通常是患者的淋巴细胞)与刺激细胞(通常是供者或已知的标准淋巴细胞)配制成1×106/ml浓度的悬液，各加0.2ml到反应管中;放置37℃和5%CO2环境下培养5～6天。培养结束后进行涂片染色，观察并计数转化的淋巴细胞;也可在培养结束前5～12小时加入3H-TdR，收获后用液体闪烁仪计数细胞的放射性。试验结果的常用表示方式是刺激指数(SI)。

　　MLC分为双向法和单向法。双向MLC是反应管中两种细胞都有应答能力，可以互为刺激细胞和反应细胞，试验结果是两种细胞反应之和。

　　SI=2×试验管cpm/(A对照cpm+B对照cpm)

　　双向MLC只能反映两种细胞间LD的差别，结果比较模糊，也不能做LD抗原的分型。单向MLC是将刺激细胞用丝裂霉素C(mitomycinC)或X线照射先行灭活，但细胞的抗原性保持不变，因此可作为刺激细胞而不能作为反应细胞，试验结果是待检测细胞的反应，使于结果分析。

　　SI=试验管cpm/自身对照cpm

　　单向MLC可以用来进行HLD-D和DP位点的分型试验，常用的方法有两类：纯合子分型细胞(homozygoustypingcell，HTC)试验和预敏淋巴细胞分型(primedlymphocytetyping，PLT)试验。

　　2.HTC试验HTC是指细胞内一对同源染色体上两个HLA单倍型完全相同，所以该位点在细胞表面只表达一种抗原;HTC可从近亲婚配的子代表中寻找。将一组HTC经处理来活后作为刺激细胞，与待检细胞做单向MLC。如果待检细胞与刺激细胞的LD不同，就会发生反应;如果相同便不反应;所以试验又称为阴性分型法。当SI≤2时可认为待检细胞与该管HTC的LD抗原相同。本法的缺点是HTC难以得到，而且培养时间长(5～6天)，在尸体器官移植时不能应用。

　　3.PLT试验本方法需事先准备分型细胞：选择只有一个单倍型相同的两个体a/b和a/c(这在双亲与子女之间不难做到)，取前者的淋巴细胞处理后作刺激细胞，取后者的淋巴细胞作反应细胞;将两者进行单向混合培养，至第10天使可得到针对b单倍型有特异性免疫应答能力的预致敏分型细胞(PTL)。依此类推，可以制备出一系列能识别各种已知LD抗原的一套PTL;这些处于休止状态的致敏记忆细胞可在液氮中长期保存备用。

　　进行PLT试验时，需将待检淋巴细胞处理成刺激细胞，而PTL为反应细胞;如果待检细胞的LD抗原与PTL预先识别的特异性相同，则PTL会迅速出现反应(二次应答)，如不同则不出现快速反应，所以本法又称为阳性分型法。PLT法克服了HTC法试验周期长的缺点，在24小时内即可报出结果;PTL比HTC容易得到，但真正做起来也复杂。

　　不管是CDC试验还是MIC方法，都必须以受检者的淋巴细胞作为检测标本，这就大大地限制了检测方法的应用范围;而且还存在抗体来源困难、细胞培养周期过长等缺点;所以近年来将分子生物学技术引入了HLA检测的领域，产生了DNA分型法。DNA分型法是利用PCR技术将标本中的少量目的DNA大量扩增，然后再进行产物鉴定的方法(原理和步骤在此不予讨论)，特点是灵敏度高，试剂来源容易，应用范围广，陈旧的或微量的标本都可进行检测，在移植医学、法医学和其他方面都有广阔的前途。